Após um período de recesso e um final de ano conturbado, volto a postar aqui com um assunto que aflige muitos cientistas que trabalham com cultura celular, as tão temidas contaminações pr bactérias. No meu caso, o que me causou muita dor de cabeça em 2009 foram as contaminações por micoplasma, então vou escrever aqui algumas coisas que li e aprendi a respeito neste período, além das minhas prórpias experiências.
Micoplasmas são microorganismos com ausência de parede celular rígida, pertencentes à classe Mollicutes. São os menores organismos conhecidos com capacidade de auto-replicação e podem localizar-se tanto aderidos à membrana da célula hospedeira, como podem invadir a célula.O grande problema da contaminação por micoplasma é que você simplesmente não sabe que ela está lá apenas olhando num microscópio ou a olho nu (como no caso das contaminações por fungos). Assim, só se sabe que há alguma coisa errada em sua cultura quando o crescimento passa a ser mais lento que o usual. Ainda sim, em estágios iniciais de contaminação nenhum efeito fenotípico é observado. Desta forma, testes periódicos devem ser feitos nas linhagens mantidas em cultura para averiguar sua qualidade.
Micoplasmas podem causar, além de uma dimiuição do crescimento celular, uma série de outras alterações fenotípicas que podem interferir no resultado do estudo em andamento.
Culturas celulares devem passar por testes rotineiros para detecção de micoplasma e, se o resultado for positivo, estas culturas devem ser descartadas e substituídas (o que nem sempre podemos nos dar ao luxo), ou devem ser submetidas a tratamentos de combate a essas contaminações. Cultura de células primárias ou culturas em baixas passagens apresentam menor incidência de contaminação em relação à culturas contínuas.
A troca constante de culturas celulares entre laboratórios sem assegurar-se da qualidade das mesmas é uma importante forma de disseminação do micoplasma. O grande problema é que este tipo de contaminação não é rara. Em trabalho recente foi observado que quase 1/3 das culturas estudadas estavam contaminadas com micoplasma, e outros estudos apontam porcentagens ainda mais alarmantes. Na década de 60 e 70, a maior parte da cotaminação era proveniente do soro utilizado nas culturas de células. Hoje em dia, apesar de muitas empresas assegurarem que o soro vendido é livre de micoplasmas, estes ainda são importante fonte de contaminação. Muitas culturas, por outro lado, apresentam contaminação por micoplasmas de origem humana, o que indica que á manipulação incorreta da cultura é também uma importante fonte de contaminação.
Existem diversas formas de detecção de micoplasma que podem ser empregadas em testes rotineiros, sendo eles os métodos de detecção direitos (crescimento de colônia em ágar) ou indiretos (como PCR). Um dos métodos de detecção mais utilizados atualmente é o PCR, por ser rápido, fácil de fazer, de relativo baixo custo e de maior sensibilidade em relação aos ouitros métodos. Neste caso, são desenhados primers específicos para uma região da subunidade 16S do RNA ribossômico, a qual tem alto grau de conservação entre todas as espécies de micoplasmas.
Após certificar-se que sua cultura está contaminada, o passo seguinte mais recomendado é a eliminação desta cultura e sua subtituição por outra correspondente livre de contaminação. Porém, como já menconei antes, nem sempre esta solução é possível uma vez que algumas culturas não podem ser substituídas. Neste caso, estas culturas podem ser submetidas a tratamentos, que dividem-se em 4 categorias: físicos, químicos, imunológicos ou quimioterapêuticos. Cada um tem suas vantagens e desvantagens e devem ser usado em diferentes tipos de casos. Entre estes, os quimioterapêuticos (no caso, antibióticos) são os de maior eficiência e, por isso, os mais utilizados.
Os antibióticos mais comumente utilizados em culturas celulares, como a penicilina e streptomicina, apenas mascaram a presença dos micoplasmas ao inibir seu crescimento, mas não provocam sua erradicação. Micoplasmas, na presença de certos antibióticos, podem desenvolver resistência à eles e mesmo os antibióticos mais efetivos podem causar efeitos citotóxicos. Os dois antibióticos mais utilizados no tratamento do micoplasma são a tetraciclina e a ciprofloxacina. A Tetraciclina atua ligando-se aos ribossomos e impedindo a elongação da tradução, atuando tanto na inibição da sintese proteína de procariotos quanto de eucariotos. Já as Quinolonas (classe à qual pertence a Ciprofloxacina) atuam inibindo replicação do DNA, transcrição, reparo e recombinação, tendo maior seletividade por proteínas procaritóticas mas podendo atuar também eu células eucariontes. Em diversos estudos, foram observados que após tratamento, a maior parte das culturas celulares é "curada". Em alguns casos, porém, pode ocorrer resistência e conseqüente não descontaminação, além de poder ocorrer morte celular devido aos efeitos citotóxicos causados pelo tratamento.
Para evitar toda essa dor de cabeça, algumas medidas simples podem ser tomadas para evitar contaminação de culturas celulares por microorganismos, sendo algumas delas: higienização correta das mãos antes da manipulação, evitar falar no fluxo, posicionamento do fluxo em locais de baixa corrente de ar (distante de portas, por exemplo), uso de pipetas descartáveis, entre outros.
Bibliografia recomendada:
